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本生帶您了解、小分子化合物(熒光染料)
更新時間:2023-05-23瀏覽:1036次

  本生帶您了解、小分子化合物(熒光染料)


  熒光染料是指吸收某一波長的光波后能發(fā)射出另一波長大于吸收光的光波的物質(zhì)。由于靈敏度高,操作方便,逐漸取代了放射性同位素作為檢測標(biāo)記,其廣泛應(yīng)用于熒光免疫,細(xì)胞染色等。熒光染料即可以單獨(dú)使用,也可以組合成復(fù)合熒光染料使用,用于染色體分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等相關(guān)研究。另有很多核酸染料在多色染色系統(tǒng)中是非常有用的復(fù)染劑,可作為背景對照,標(biāo)記細(xì)胞核使細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系一目了然。

  常用核酸染料

  DAPI是結(jié)合富含A-T堿基對DNA序列的熒光染料。DAPI是一種能夠與DNA中大部分A,T堿基相互結(jié)合的熒光染料﹐常用于熒光顯微鏡觀測。因?yàn)镈API可以透過完整的細(xì)胞膜﹐它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。當(dāng)DAPI與雙鏈DNA結(jié)合時,最大吸收波長為358nm,最大發(fā)射波長為461nm。DAPI的發(fā)射光為藍(lán)色,且DAPI和綠色熒光蛋白GFP或Texas Red染劑(紅色熒光染劑)的發(fā)射波長僅有少部分重疊,可以利用這項(xiàng)特性在單一的樣品上進(jìn)行多重?zé)晒馊旧?/p>

  一般的,用于細(xì)胞核染色時,推薦的DAPI工作濃度為0.5-10μg/mL。

  Hoechst 33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料,它在嵌入雙鏈 DNA后釋放強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光,對細(xì)胞的毒性較低。Hoechst 33342染色常用于細(xì)胞凋亡檢測,染色后用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測。Hoechst 33342也常用于普通的細(xì)胞核染色,或常規(guī)的DNA染色。Hoechst 33342的最大激發(fā)波長為346nm,最大發(fā)射波長為460nm;Hoechst 33342和雙鏈DNA結(jié)合后,最大激發(fā)波長為350nm,最大發(fā)射波長為461nm。

  細(xì)胞凋亡檢測

  JC-1是一種廣泛用于檢測線粒體膜電位△Ψm的理想熒光探針。在線粒體膜電位較高時,JC-1 聚集在線粒體的基質(zhì)中,形成聚合物,可以產(chǎn)生紅色熒光;在線粒體膜電位較低時;JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中,此時JC-1為單體,可以產(chǎn)生綠色熒光。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個標(biāo)志性事件。通過JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測到細(xì)胞膜電位的下降,同時也可以用JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個檢測指標(biāo)。

  活性氧檢測

  DCFH-DA本身沒有熒光,可以自由穿過細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后,可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜,從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。

  ROS熒光探針-DHE

  DHE是一種可滲透細(xì)胞的藍(lán)色熒光探針,是過氧化物指示劑,可用于檢測細(xì)胞內(nèi)superoxide radical anion,能有效地檢測活性氧類。這種染料可以自由地進(jìn)入細(xì)胞中,脫氫后成為Ethidium。DHE可以直接用于活細(xì)胞的標(biāo)記。DHE被活細(xì)胞攝入后,可以在細(xì)胞內(nèi)的超氧化物陰離子作用下脫氫,產(chǎn)生Ethidium。Ethidium可以和RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的超氧化物陰離子水平較高時,產(chǎn)生的Ethidium較多,紅色熒光就較強(qiáng),反之則較弱。DHE本身為藍(lán)色熒光,最大激發(fā)波長為370nm,最大發(fā)射波長為420nm,脫氫后和RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光,最大激發(fā)波長為300nm,最大發(fā)射波長為610nm,實(shí)際觀察時也可以使用535nm作為激發(fā)波長。

  一般的,用于細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子檢測時,DHE的常用濃度為1-10μM。

  鈣離子濃度檢測

  Fluo-3 AM是常用的檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針之一。它穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成 Fluo-3,從而被滯留在細(xì)胞內(nèi),F(xiàn)luo-3若以游離配體形式存在時幾乎是非熒光性的,但是當(dāng)它與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光,最大激發(fā)波長為506nm,最大發(fā)射波長為526nm。實(shí)際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右,發(fā)射波長為525-530nm??梢允褂眉す夤簿劢癸@微鏡或流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。

  其他染料

  尼羅紅是一種親脂性的惡嗪類熒光染料,與脂類物質(zhì)結(jié)合并發(fā)出熒光,在激發(fā)波長530nm激發(fā)下,顯示強(qiáng)烈桔紅色熒光。常用于檢測細(xì)胞內(nèi)脂滴。

  Calcein-AM是一種可對活細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記的細(xì)胞染色試劑,它穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Calcein,從而被滯留在細(xì)胞內(nèi),發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。Calcein的激發(fā)和發(fā)射波長分別為490nm和515nm。Calcein-AM和PI經(jīng)常被結(jié)合用來作為活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色。

  FITC是在熒光素的基礎(chǔ)上通過化學(xué)反應(yīng)增加(異)硫氰酸基團(tuán)得到的,硫氰酸基團(tuán)可以和生物活性物質(zhì)例如蛋白質(zhì)上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)形成硫脲鍵,從而實(shí)現(xiàn)對生物活性物質(zhì)的熒光標(biāo)記。FITC能和各種抗體蛋白等物質(zhì)結(jié)合,通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可進(jìn)行定性、定位或定量的檢測。

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